Leica激光扫描共聚焦显微镜

仪器型号：Leica TCS SP8

仪器编号：Y001、Y002

操作规程

一、   开机

1.固体激光器:

 依次打开电脑桌右侧“PC Microscope”、“Scanner Power”三个圆形按钮，然后将”Laser Emission”钥匙顺时针旋转90度至”On-1”位置。记录开机时间。

2.打开显微镜（CL6000）电源和荧光(EL6000)电源。

3.打开电脑开关，双击电脑显示屏桌面上的“LAS X”图标启动徕卡共聚焦软件。

4.如需使用快扫系统，在“Resonant Scanner”选项前“On”。

5.点击“OK”以打开软件。打开后显示LAS X基本界面。

6.点击Laser, 打开激光开关。

二、在显微镜下观察样品

1.选择合适的物镜，可通过显微镜上的触屏模式转换不同模式，或软件中的“Objectives”键进行选择。

2.将样品置于载物台上，在明场条件下选择合适的视野。通过显微镜主机右侧的按钮进行调焦，通过显微镜主机左侧的“INT”功能键调节光强。

3.按“TL/IL”功能键转换至荧光观察方法，通过显微镜前面板的按钮选择合适的荧光滤块，进行样品的荧光观察。

4.观察完毕后，按显微镜前面板上的荧光“SHUTTER”键以保护样品。

三、采集共聚焦图像

1.点击“Aquire”进行光路设置。调用已有的设置：选择“Load/Save single setting”下拉菜单中已有的设置（激光及其输出功率、分光镜、检测波长范围、PMT的gain及offset），常用的荧光染料都已包含在内。选择某一设置后，可按样品的实际需要对参数进行优化（如后述），并以新的名称保存。

修改已有设置：可改变所选激光、调节激光输出功率、改变分光镜、改变所选PMT、调节PMT检测范围、调节PMT的gain或offset等。

2. 建立新的设置：也可从零开始建立新的设置。选择所需激光及其功率、适宜的镜、PMT及检测波长范围。对于双重或多重染色的样品，可选择同时采图或序列采图的方式。推荐使用后者，因其可避免染料交叉派发和串色导致的结果不准确。进行序列扫描前，需分别设置每一通道的采图参数。

3.透射光检测器的选择单击“Additional Channels”以显示透射光检测器（“PMT Trans”），选择观察方法（BF、DIC等）。

4.选择扫描模式在“Acquire”菜单本部门的“Acquisition”中选择扫描模式（“Acquisiton Mode”）。默认模式为xyz扫描，是最常用的扫描模式，可用于xy扫描和z轴层切（xyz扫描）。还可按样品扫描需要在下拉菜单中选择由x，y，z，t（时间）以及λ（波长）组合而成的多维扫描模式。Xzy，xyt，xyλ，xyzt，xyzλ，xyzλt等。

5.设置扫描参数。在“Acquire”菜单栏的“Acquisition”中设置扫描参数，包括分辨率pixel format、扫描速度（scanning speed）、针孔大小（pinhole size）、线平均（line averaging）、面平均（frame averaging）、累加（accumulation）及放大倍数(ZOOM)等。

分辨率：默认值为512×512。也可选择更低或更高分辨率。分辨率越高，所获取的图像文件也越大。扫描速度：默认值为400Hz。活细胞或运动的样品成像可能需要更快的速度。可选择双向扫描（bidirectional scanning）来达到更高速度，这时可能需要进行相位（Phase）调节。针孔大小：默认值为1Airy。如果样品的荧光非常弱，可通过增大针孔直径来增加信号强度，但所获取图像不是真正的共聚焦图像。平均：用于降低背景噪音。分为线平均（Line averaging）和面平均（Frame averaging），线平均较快。可在下拉菜单中选择平均的次数。两种平均方式可结合使用。累加：仅用于荧光非常弱的样品。

6.预览图像点击“Live”以设定的扫描参数预览图像，图像将显示在右侧的显示屏上。

7.优化扫描参数预览图像时，调节z轴位置找到最适合观察的焦平面，并调节PMT的电压（PMT gain）及偏移（PMT offset），或激光输出功率使图像达到最佳。可通过控制面板上相应旋钮调节以上参数。理想的荧光图像中应该只有少数象素点达到饱和（即灰阶为255）可通过位于图像左侧的LUT按钮进行观察。LUT按钮可在LUT(即指定的荧光颜色)、“Glow Over Under(GlowOU)”和灰度图三档之间切换。在GlowOU中，灰阶为255的象素点显示为蓝色，而灰阶为0的象素点显示为绿色。调节PMT的电压使图像中仅少数象素点显示蓝色。应使用较低的激光输出功率和较高的PMT电压值，这有助于保护样品免受光漂白的影响。可通过调节PMT的偏移值来降低图像的背景。荧光图像PMT偏移的默认值为0%，且调节过程中不应使其大于0%。

对透射光图像，同样可以调节透射光PMT的电压和偏移值来进行优化。但有时可将偏移值调至高于0%以增加对比度。图像调至满意后，单击“Stop”终止预览过程。

8.采集图像。单击“Capture Image”采集图像。在此之前可改变分辨率、线/面平均次数等扫描参数。通常情况下，预览图像时选择512×512的分辨率，而采集图像时可增加至1024×1024。

四、序列扫描

如果样品采用两种或两种以上荧光染料标记，为避免串色对实验结果的影响，可采用序列扫描的方式。

1.单击“Acquisition”中的“seq”按钮，软件界面中将出现序列扫描菜单，可通过“Scan 1”右侧的“+”添加更多的扫描序列（“Scan 2”，“Scan 3”……）。

 2. 调用所需的单一采图设置，预览并优化参数至满意后，点击“Scan 1” 将参数定义至第一扫描序列。

 3. 同法定义“Scan 2” 及更多的序列。

 4. 扫描顺序“between lines” 适合大多数的应用，特别是活细胞成像。

 5. 调整分辨率、线/面平均次数等扫描参数后，点击“Start”进行序列图像的采集。

 6. 可保存序列扫描的设置以便将来调用。

五、z轴层切(xyz扫描)

1. xyz扫描模式为默认采图模式。

2. 选择“z-Galvo”，用SuperZ 进行z 轴调节；或“z-Wide”，用显微镜物台进行z 轴调节。

 3. 设置采图参数，方法同前。

 4. 点击“Live” 进行图像预览。用控制面板的“Z-Position” 旋钮调节z轴至层切所需的起点，点击“Begin”上方的黑色箭头定义层切起点（箭头变为棕色表示已定义）；调节z轴至层切所需的终点，点击“End”上方的黑色箭头定义层切终点。

 5. 点击“Stop”终止图像预览。

 6. 此时xyz 层切菜单中显示的“z-step size”（相邻两个光切面的间距）和“Nr. of steps” （层切数目）为系统的优化值（“system optimized”）。也可点击“Nr. of steps”左侧的按钮，然后对相邻光切面间距或层切数目进行自定义。

 7. 点击”Start”进行xyz 图像的采集。

 8. 采图完毕后，应点击“Begin”和“End”上方的棕色箭头，使其变为黑色，重新处于未定义状态。

六、关机

1. 保存已采集的图像。

2. 关闭显微镜汞灯电源。

3. 若使用过油镜，需用无水乙醚与无水乙醇混合液（体积比7：3）或无水乙醇清洁镜头。

4. 关闭LAS AF 软件。

5. 将电脑桌右侧“Laser Power” 按钮右侧的激光开关钥匙（Laser mission）逆时针旋转90 度至“On-0” 位置。

6. 关闭“Scanner Power”按钮。

7. 在电脑上进行图像数据的输出。

8. 关闭电脑后，关闭“PC Microscope” 按钮。

9. 风扇停止后（关闭激光开关钥匙约15 分钟后），关闭“Laser Power”按钮。记录关机时间、仪器状况等信息。

仪器维护

1.保持光学元件的清洁对于保证好的光学性能来说非常重要，当显微镜不用时，显微镜应当用仪器提供的防尘罩盖住。

2.若暂时不使用，可以将显微镜灯光调至最暗，不能频繁开关显微镜电源。

3.调焦时注意不要使物镜碰到试样，以免划伤物镜。   

4.亮度调整切忌忽大忽小，不要过亮，影响灯泡的使用寿命，同时也有损视力。  

5.所有（功能）切换，动作要轻，要到位。   

6.关机时要将亮度调到最小。

7.目镜和物镜若被不小心弄脏，可以用擦镜纸沾擦镜油或无水乙醇，轻轻拭擦，以免损伤目镜。

注意事项

1. 在电脑上进行图像数据的输出时，要注意使用空白光盘刻录，而不得使用任何其他形式的移动存储介质。

2.激光共聚焦的样品首先要尽量保持生物材料的天然状态，避免赝像、变形和失真，因此须将生物材料做固定处理；制片必须薄而透明，才能在显微镜下成像，除将材料切成薄片或通过轻压或其他手段使之分散外，还需采用其他方法使它透明和染色，以便更好地观察到结构的细节。需长期还应进行脱水和封固。