IAC-HPLC荧光检测法测定饲料中的玉米赤霉烯酮方法研究

Determination of zearalenone in feed—high performance liquid chromatigraphic method with immunoaffinity column clean-up

摘  要：饲料样品经乙腈-水（8+2）提取，提取液用磷酸盐缓冲溶液稀释，经免疫亲和柱净化后，净化提取液用反相高效液相色谱荧光检测器测定，可以准确检测饲料中玉米赤霉烯酮含量。IAC-HPLC荧光检测法可以有效地将玉米赤霉烯酮与其类似物区别开。利用配合饲料、预混料、鱼粉、豆粕、浓缩饲料、玉米进行玉米赤霉烯酮回收率实验，回收率在90.1%-118%之间。利用鱼粉、预混料、鸡配合饲料、玉米进行方法稳定性试验，室内相对标准偏差均在5%以内。因此，本方法中建立的免疫亲和柱净化、高效液相色谱荧光检测法具有良好的准确性、稳定性和特异性。

关键词：玉米赤霉烯酮 免疫亲和柱 高效液相色谱 饲料

Abstract: A method was developed for the determination ZEN toxin in feed by liquid chromatography with fluorescence detection after immunoaffinity column clean-up. ZEN was extracted with acetonitrile-water(80:20 V/V), and diluted with phosphate buffer solution. ZEN was differentiated from its analogue with this method. Recoveries from the different feed spiked with ZEN were from 90.1%-118%, with relative standard deviation of less than 5%. This method was accurate, reliable and sensitive.

Key words:Zearalenone;Immunoaffinity column; high performance liquid chromatography; feed

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是一种具强烈致畸作用的生殖系统霉菌毒素，我国饲料卫生标准^[1]中规定了配合饲料和玉米的允许量≤0.5mg/kg，但我国现有的ZEN检测标准^[2]中使用的薄层色谱法为半定量法、酶联免疫吸附法为筛选法，两种方法都不是准确定量法，因此，建立准确高效的检测方法对于检测和控制饲料中玉米赤霉烯酮含量具有重要意义。

免疫亲和柱（IAC）由于其高选择性、高灵敏度、净化效果好、易操作的特点而被普遍用于霉菌毒素的检测。国际标准ISO 17372:2008^[3]采用免疫亲和柱净化-高效液相色谱法对饲料中玉米赤霉烯酮进行检测，类似技术路线在检测大豆、油菜籽、植物油等中的玉米赤霉烯酮时也广泛使用^{[4, 5, 6]}。本研究旨在建立饲料中玉米赤霉烯酮的IAC-HPLC荧光检测法。

1 试验研究

1.1 仪器

振荡器；氮吹仪；高速均质器；高效液相色谱仪（配有荧光检测器）；色谱柱：C18 柱，长150 mm，内径4.6 mm，粒度5 μm；真空装置或空气压力泵；玻璃微纤维滤纸（直径11 cm、孔径1.5 μm）；试验筛（1 mm孔径）。

1.2 试剂及材料

玉米赤霉烯酮免疫亲和柱（容量≥2 μg）；乙腈；甲醇；氢氧化钠溶液：c（NaOH）=0.2 mol/L；玉米赤霉烯酮标准品，玉米赤霉烯酮含量≥99.5%；提取剂：乙腈+水（8+2）；磷酸盐缓冲溶液（PBS）：将8 g氯化钠、1.16 g磷酸氢二钠、0.2 g磷酸二氢钾、0.2 g氯化钾溶解至1000 mL水中，用氢氧化钠溶液调节pH值至7.4；流动相：量取460 ml乙腈至1000 mL的容量瓶中，加入460 mL水和80 mL甲醇。混合均匀并通过0.45 μm滤膜，备用。

1.3 标准溶液的配制

玉米赤霉烯酮标准工作液：用流动相分别配制浓度为0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.50 μg/mL、1.0 μg/mL的标准工作液。

1.4 样品前处理

1.4.1提取

称取试样40.0 g于250 mL具塞锥形瓶中，加入4.0 g氯化钠及100.0 mL提取剂，于振荡器上振荡60 min，或于高速匀质器匀质2min后，用定量滤纸过滤，准确移取10 .0mL滤液并加入40.0 mL PBS溶液稀释，用玻璃纤维滤纸过滤1~2次，至滤液澄清，备用。

1.4.2净化

   将免疫亲和柱连接于10.0 mL玻璃注射器下。准确移取10.0 mL样品提取液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，抽干。分别以10.0 mL纯水淋洗柱子两次并抽干。准确加入1.5 mL甲醇洗脱，流速不大于2 mL/min，收集洗脱液于55℃氮气吹干，用1.0 mL流动相溶解残渣，涡旋混匀，过0.45 μm滤膜，上机测定。

1.4.3测定

色谱测定流速：0.8 mL/min；检测波长：激发波长274 nm；发射波长440 nm；进样量：20 μL；柱温：30℃。分别取相同体积样液和标准溶液注入高效液相色谱仪，在同等色谱条件下测定试样的响应值（峰高或峰面积），经过与玉米赤霉烯酮标准溶液谱图比较响应值得到试样中玉米赤霉烯酮的浓度。

2 结果与讨论

2.1 干扰性试验

玉米赤霉烯酮类有六种类似物分别为玉米赤霉烯酮（ZON）、玉米赤霉醇（ZER）、β-玉米赤霉醇（β-ZAL）、α-玉米赤霉烯醇（α-ZOL）、β-玉米赤霉烯醇（β-ZOL）、玉米赤霉酮（ZAN）。

图1 紫外法检测六种玉米赤霉烯酮类图谱

该六种物质可以应用于HPLC紫外法检测，经过玉米赤霉烯酮免疫亲和柱净化后，六种物质回收率都大于80%，见图1。

六种物质中，玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇三种可以用荧光检测器检测。该三种物质应用玉米赤霉烯酮IAC净化后，从图2中可以看出，IAC-HPLC荧光检测法可以很好地将三种物质分开。

图2 荧光法检测三种玉米赤霉烯酮类似物图谱

2.2标准曲线与线性范围

配制ZEN标准液浓度分别为5、20、50、200、500μg/mL，按上述实验条件进样，以所得峰面积A对浓度（μg/mL）进行回归分析，结果表明线性关系良好（见图3）。回归方程为y=1848.6x-4843，相关系数为0.9999。

图3 玉米赤霉烯酮标准工作曲线

2.3 准确度与精密度试验

分别选择配合饲料、预混料、鱼粉、豆粕、浓缩饲料、玉米不同产品进行回收率试验。空白样品选择不含有玉米赤霉烯酮或含量较低的样品（含有玉米赤霉烯酮的需扣除空白，见图4）。样品中添加不同浓度的标准溶液，充分摇匀，使标准溶液与样品充分吸收，按照本实验方法进行测定，其回收率见表一。

表一 饲料中玉米赤霉烯酮添加的回收率试验

上述不同样品，添加浓度分别为10μg/kg、50μg/kg、100μg/kg、150μg/kg、200μg/kg、500μg/kg的情况下，回收率在90.1%-118%之间，平均回收率为98.9%。回收效果较好。

利用鱼粉、预混料、鸡配合饲料、玉米进行添加试验。样品中添加不同浓度的标准溶液，充分摇匀，使标准溶液与样品充分吸收，每个添加水平重复测定7-9次，按照本实验方法进行测定，其回收率相对偏差见表二。

表二 饲料中玉米赤霉烯酮添加的回收率试验

（%）

从表中数据可以看出，在本方法规定的条件下，回收率数据在80.3%～102.3%之间，平均回收率92.70%，室内相对标准偏差均在5%以内。

图4 玉米、鱼粉、鸡配合饲料空白样品及部分添加样品的对照色谱图

3  结论

玉米赤霉烯酮六种类似物中只有玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇可以用荧光检测器检测出来，通过图谱可以看出，此方法能较好地将这三种物质区分。本试验利用配合饲料、预混料、鱼粉、豆粕、浓缩饲料、玉米进行玉米赤霉烯酮回收率实验，添加浓度分别为10μg/kg、50μg/kg、100μg/kg、150μg/kg、200μg/kg、500μg/kg，回收率在90.1%-118%之间，平均回收率为98.9%。利用鱼粉、预混料、鸡配合饲料、玉米进行方法稳定性试验，室内相对标准偏差均在5%以内。因此，本方法中建立的免疫亲和柱净化—荧光检测器的高效液相色谱法具有良好的特异性、准确性和稳定性。